Le jeune Bruce Wayne assiste impuissant au meurtre de ses parents. Profondément traumatisé, il grandit obnubilé par un désir de vengeance et voyage aux quatre coins du monde pour étudier la criminologie et les arts martiaux. La Ligue des ombres, une secte de guerriers ninja dirigée par Ra's al Ghul, se chargera de son entraînement physique. De retour chez lui à Gotham City, le jeune homme se charge de la gestion de Wayne Enterprises dont il est l'héritier. Opérant depuis le sous-sol du manoir familial avec l'aide de son majordome Alfred Pennyworth, Bruce Wayne se lance alors dans la lutte contre le crime sous le nom de Batman.
Batman et Robin sont invités à une démonstration très secrète animée par le professeur Hugo Strange et son assistant, le Dr Harleen Quinzel, qui pourrait éventuellement changer à jamais le futur de Gotham. En cours de route, Batman s'arrête au pénitencier d'État de Gotham pour rendre visite à Catwoman (dont la tentative de suicide du premier film a échoué) pour lui remettre un livre de poésie d'Elizabeth Barrett Browning. C'est quelque chose qui la tiendra occupée pendant les 36 prochains mois de sa vie jusqu'à ce qu'elle soit définitivement libérée de prison. Au laboratoire, ils rencontrent le procureur et allié de Bruce Wayne dans la guerre contre le crime Harvey Dent, célèbre pour avoir arrêté un gang de contrefacteurs de pièces tout en conservant un quartier à deux faces en souvenir de l'affaire.
À l'asile d'Arkham, un prisonnier apprend au Joker et au Pingouin qu’il a dissimulé une immense fortune dans le cimetière de Gotham. Les deux criminels parviennent à s’évader dans l’espoir de mettre la main sur le trésor. Batman, lancé à leur poursuite, ne tarde pas à retrouver le Joker qui, après un combat, tombe dans la rivière et s’électrocute avec l’un de ses gadgets.
Plusieurs chefs de la pègre locale sont décédés à la suite d'attentats perpétrés par une silhouette fantomatique qui rôde à Gotham City. Alors que les autorités de la ville accusent Batman de ces meurtres, Bruce Wayne doit affronter son passé émotionnel quand son ex-fiancée, Andréa Beaumont, revient d'Europe.
Batman, Batgirl et Robin forment une alliance avec les Tortues Ninja pour affronter Shredder qui s'est apparemment joint à Ra's al Ghul et sa Ligue des Assassins, afin de pouvoir prendre le contrôle de la ville.
Le Joker a capturé Jason Todd alias Robin l'allié de Batman, et le torture jusqu'à ce que Batman arrive pour sauver son apprenti. Le sauvetage échoue quand le bâtiment explose. Batman se remet difficilement de la mort du second Robin lorsque ce qui semble être une guerre des gangs éclate dans Gotham. Le baron actuel de la pègre, Black Mask, voit en effet ses activités attaquées par un nouvel arrivant, Red Hood. Ce dernier prend peu à peu le contrôle de la drogue dans la ville. Ses méthodes extrêmement violentes déclenchant un début d'escalade.
À Gotham City, un nouveau méchant fait régner la terreur par le froid, Mister Freeze. De son vrai nom Victor Fries, cet ancien scientifique a été victime d'un accident lors de ses recherches sur la cryogénie. Il ne peut désormais plus supporter de température supérieure à 0 degré. Son objectif est de prendre la ville en otage, en échange de fonds pour financer ses recherches d'un traitement contre le « syndrome de MacGregor », une maladie rare contractée par sa femme.
Le professeur Hammil a créé un dispositif qui lui permet de contrôler les véhicules à distance. Son invention est dérobée. Batman et Robin, assistés par la journaliste Vicki Vale, partent à la recherche de cette invention qui est tombée dans de mauvaises mains.
Double-Face affronte Batman à Gotham City tandis que le docteur Chase Meridian s'intéresse au profil psychologique du Chevalier Noir. Un nouveau personnage va alors faire son apparition, l'Homme-Mystère. Toutefois, Batman pourra bientôt compter sur un nouvel allié pour affronter les deux supers-vilains...
Alors qu'il combat Gorilla Grodd, Batman est pris dans sa machine temporelle et est envoyé au Japon féodal. Il y est chassé par des samouraïs au service du Joker. En s'échappant, il rencontre Catwoman, elle aussi prise dans le temps depuis deux ans, qui lui apprend que les criminels de Gotham sont tous là et sont devenus des Seigneurs féodaux après avoir abusé le daimyō. Batman et Catwoman doivent donc intervenir pour empêcher les vilains de ré-écrire l'histoire.
La ville de Gotham est attaquée par la « Guerillanimale », des super-vilains « animaux » comme le Pingouin, Silverback, Cheetah, Killer Croc et Man-Bat. Batman s'unit à d'autres héros pour les stopper.
Mister Freeze et Le Pingouin sont de retour à Gotham City. Après avoir réfrigéré la ville, le scientifique transforme Bane et Killer Croc en monstres géants dévastant tout sur leur passage. Afin de les combattre, Bruce Wayne élabore un robot géant de Batman et le combat commence. Dans sa quête pour ramener la paix, le super héros sera suivi dans son affrontement par Robin, Green Arrow, Nightwing et Flash.
C'est Halloween à Gotham City. Pour fêter ça, les plus grands méchants de la ville ont tous uni leurs forces pour mettre en place une série de crimes. Batman se lance dans l'action pour les arrêter, rejoint par Green Arrow, Cyborg, Nightwing et Red Robin. Mais il semble que les méchants travaillent pour le pire d'entre eux, le Joker, qui a une surprise : un virus informatique qui fait rire tous les logiciels et qui les force à lui obéir. Est-ce que les héros peuvent arrêter le virus avant qu'il ne transforme tout Gotham en Jokerville ? Batman va-t-il trouver un moyen de battre le Joker maintenant que ses fidèles gadgets et véhicules ont succombé au virus ?