Le film est divisé en quatre actes distincts. Daniel Richter incarne l'Australopithecus afarensis qui découvre l'usage de l'outil après avoir touché le monolithe dans le premier acte qui se déroule « à l'aube de l'humanité » ; William Sylvester joue le docteur Heywood R. Floyd dans le second acte quand, en 2001, le même monolithe est découvert sur la Lune. Keir Dullea (Dr David Bowman) et Gary Lockwood (Frank Poole) apparaissent dans le troisième acte en tant qu'astronautes entreprenant un voyage vers Jupiter à bord du vaisseau Discovery One, suivant le signal émis par le monolithe lorsqu'il a été découvert sur la Lune. Douglas Rain est la voix de l'ordinateur de bord sentient HAL 9000, qui commande toutes les fonctions du vaisseau. Dans l'acte final, le film suit le périple de l'astronaute David Bowman « au-delà de l'infini ».
Sur Terre, dans un futur proche, l’ingénieur et astronaute de la NASA Roy McBride s'occupe de la maintenance d'une antenne de 30 km de hauteur. Celle-ci est détruite lors d’une surcharge électrique venue de Neptune, qui cause des ravages également sur Terre.
Après que la NASA ait officiellement mis fin au programme Apollo en 1974, une dernière mission sur la Lune aurait été effectuée. Le film, basé sur le tournage récupéré de l’équipage, raconte l’alunissage d’Apollo 18 et les raisons de sa dissimulation. Le capitaine Benjamin Anderson et le major Nathan Walker, ainsi que le lieutenant-colonel John Gray, ont été choisis pour le mener à bien en secret. Cependant, les causes qui ont conduit à l'échec et qui sont capturées dans la bande retrouvée n'ont jamais été rendues publiques par le gouvernement américain, car il s'agissait d'une preuve de contact pour la première fois avec des êtres extraterrestres, dont le ministère de la Défense (DOD) des États-Unis et le gouvernement de l'Union soviétique connaissaient déjà l’existence. Le film révèle ensuite le secret le mieux gardé de l’agence spatiale américaine et explique pourquoi aucune autre mission habitée n'a été envoyée vers la Lune. ll montre également que les astronautes ont trouvé les restes d’une mission soviétique qui avait la même finalité que la leur.
1965, une station spatiale japonaise est détruite par des ovnis, alors qu' une série de catastrophes inexplicables s'abat sur le monde. Venise est engloutie sous les eaux et, après la destruction du Golden Gate par un missile spatial, il devient évident que la Terre est l'objet d'une attaque extraterrestre lancée depuis la Lune.
Un scientifique et un militaire américains, le docteur Cargraves et le général Thayer, travaillent sur un projet de conquête de la Lune. Pour financer le développement d'une fusée à propulsion nucléaire et la construction d'une base de lancement, ils s'assurent le concours de grands industriels du secteur privé, en faisant jouer leur fibre patriotique. Ils triompheront de tous les obstacles (notamment l'émotion que soulève dans le public le risque de contamination radioactive) pour mener à bien leur projet.
Dirk Green est un ingénieur qui a construit une fusée pour atteindre la Lune. Le gouvernement lui envoie un militaire qui lui explique que ce genre d'expérimentation ne peut se faire à titre privé et que son projet doit passer sous l'égide gouvernementale. Green n'est pas d'accord du tout alors que ses deux collaborateurs Steve et June le seraient plutôt.
2018. Une mission lunaire est envoyée dans l'espace à des fins électoralistes pour aider à la réélection d'une présidente américaine en difficulté et pour trouver des gisements d'hélium 3 sur la face cachée de la Lune, élément nécessaire à une future exploration spatiale. Les deux astronautes tombent sur une patrouille de nazis qui s'y cachent ; l'un est abattu, l'autre, un noir dénommé Washington, est capturé.
2047. Vingt neuf ans ont passé depuis l'affrontement nucléaire entre les Terriens et les nazis de la lune. Neomenia, l’ancienne base lunaire des nazis, est devenue le dernier refuge de l’Humanité, car la Terre a été dévastée par le conflit. Cependant, ses entrailles cachent une puissance qui pourrait sauver les derniers humains … ou les détruire définitivement. Face à la menace, quelques réfugiés de la Lune vont se rendre au centre de la Terre. Ils y affronteront une race reptilienne extraterrestre.
Des scientifiques partent en mission sur la planète Mars, mais une soucoupe volante quelque peu belliqueuse les force à rebrousser chemin. De retour sur Terre, ils réalisent qu'ils ont malencontreusement ramené de l'espace une créature surpuissante, qui ravagera tout sur son passage.
1969 : l'homme s'apprête à poser son premier pas sur la Lune. Le souffle coupé, le monde attend des images qui, pour des raisons techniques sont obtenues par le biais d'une antenne géante située dans un village du fin fond de l'Australie. Tout devait bien se passer, mais évidemment…
Le professeur Manfeldt est moqué par ses confrères lorsqu'il prétend qu'il existe des mines d'or sur l'astre lunaire. Trente ans plus tard, Wolf Helius souhaite construire une fusée pour aller sur la Lune. Friede Velten et l'ingénieur Hans Windegger sont intéressés par ce projet. Un groupement financier contrôlant le marché de l'or impose sa participation à leur expédition.
Une barque se déplace en pleine mer, avec trois hommes à bord : le grand-père, le père et le jeune garçon, lequel reçoit en cadeau la même casquette que ses aînés, qui se disputent au sujet de la façon dont le petit doit porter son couvre-chef. Ensuite ils s'assoient et attendent. Le jeune garçon, se demandant que faire, imite les gestes des deux autres.
Alors qu'il travaille dans son observatoire, un astronome voit apparaître un diablotin et une noble dame. Il dessine ensuite des corps célestes, qui s'animent alors sur le tableau noir. Puis ses meubles disparaissent, et alors qu'il souhaite regarder la Lune avec un immense télescope, celle-ci lui apparaît, un mètre devant lui, et mange son instrument. Elle détruit également d'autres objets, et deux enfants déguisés en Pierrot sortent de sa bouche. L'astronome veut la frapper, mais elle recule, puis se transforme en croissant, sur lequel repose une jeune fille, qui enfin apparaît près de l'astronome; elle s'envole alors. L'astronome est ensuite mangé par la Lune, qui recrache ses membres; le diablotin joue avec et la dame le reconstitue. Puis, l'astronome revient dans son observatoire.
Le duché du Grand Fenwick a un problème : son château n'a plus d'eau chaude. Afin de récolter les fonds nécessaires pour la réparation de la plomberie, le Grand Fenwick réclame de l'aide auprès des États-Unis, et en particulier son département de recherches spatiales. Les Russes envoient eux aussi de l'aide pour montrer qu'ils sont également partisans de l'internationalisation de l'espace. Tandis que le grand-duc rêve de bains chauds, le seul scientifique de l'État met tant bien que mal au point une fusée. États-Unis et Soviétiques ont vent du lancement imminent de l'engin et entrent alors dans une compétition pour être les premiers à atteindre la Lune.