Ce documentaire est consacré à l'histoire des super-héros américains depuis leur apparition dans les années 1930. Il présente de nombreux dessins issus des comics originaux, des extraits de leurs adaptations en films et dessins animés, ainsi que des entretiens avec des auteurs importants du genre.
Un ennemi de Batman, 40 ans après avoir disparu de la scène, refait surface. Bruce Wayne semble connaître la raison de cette longue disparition du Joker. Il est ainsi certain qu'il ne peut s'agir de la même personne. Lui et Terry McGinnis tentent de découvrir la véritable identité du vilain, et son plan. Au fur et à mesure de l'enquête, les destins de plusieurs autres personnages sont révélés, comme celui de Tim Drake, le troisième Robin.
Un soir à Gotham City, le Joker et Harley Quinn dérobent une statue chez un antiquaire. Celle-ci, sans réelle grande valeur, est en fait un objet fait de kryptonite (le point faible de Superman). Le Joker se rend ensuite à Métropolis afin de conclure un marché avec le milliardiare Lex Luthor : éliminer Superman en l'échange d'un milliard de dollars. Batman et Superman vont ainsi devoir mettre leur force en commun afin de vaincre leurs deux plus redoutables ennemis respectifs...
Lorsque Mr Freeze séquestre Batgirl pour lui prélever des organes afin de ramener à la vie sa défunte épouse, c'est au tour de Batman et Robin de les retrouver avant que la chirurgie ne débute.
À Gotham City, un nouveau méchant fait régner la terreur par le froid, Mister Freeze. De son vrai nom Victor Fries, cet ancien scientifique a été victime d'un accident lors de ses recherches sur la cryogénie. Il ne peut désormais plus supporter de température supérieure à 0 degré. Son objectif est de prendre la ville en otage, en échange de fonds pour financer ses recherches d'un traitement contre le « syndrome de MacGregor », une maladie rare contractée par sa femme.
Double-Face affronte Batman à Gotham City tandis que le docteur Chase Meridian s'intéresse au profil psychologique du Chevalier Noir. Un nouveau personnage va alors faire son apparition, l'Homme-Mystère. Toutefois, Batman pourra bientôt compter sur un nouvel allié pour affronter les deux supers-vilains...
Plusieurs chefs de la pègre locale sont décédés à la suite d'attentats perpétrés par une silhouette fantomatique qui rôde à Gotham City. Alors que les autorités de la ville accusent Batman de ces meurtres, Bruce Wayne doit affronter son passé émotionnel quand son ex-fiancée, Andréa Beaumont, revient d'Europe.
À Gotham City, un couple fortuné, Tucker et Esther Cobblepot (Paul Reubens et Diane Salinger), abandonne son enfant à la naissance en le jetant dans les égouts à cause de sa difformité. Il est recueilli et élevé par les manchots du zoo. Trente-trois ans plus tard, Oswald Cobblepot (Danny DeVito) a grandi dans les égouts et refait surface comme un criminel nommé Le Pingouin. Il kidnappe un industriel millionnaire, Max Shreck (Christopher Walken). À cause des preuves rassemblées par le Pingouin des activités criminelles des affaires de Shreck, ce dernier lui propose de le sortir des égouts et de le faire entrer dans l'élite de Gotham. Le Pingouin élabore un plan pour faire son entrée dans le monde public en se faisant passer pour un héros. Il fait kidnapper le fils du maire pour ensuite le délivrer lui-même. Malgré la popularité du Pingouin, le millionnaire Bruce Wayne, alias Batman (Michael Keaton), reste sceptique sur ce dernier. Il enquête sur le passé du Pingouin et établit un lien avec un gang de criminels, le Gang du Cirque du Triangle Rouge. Le gang a récemment fait des ravages sur Gotham, entrainant la disparition de plusieurs enfants. Il décide de défendre Gotham contre eux.
Enfant, le milliardaire Bruce Wayne voit ses parents assassinés par un voleur des rues, qui en voulait au collier de perles de la mère de famille. L'orphelin se jura de venger leur mort en se lançant dans une bataille à vie contre le crime organisé. Pour cela, il crée un justicier masqué nommé Batman, et cache cette identité secrète derrière celle d'une image de playboy flambeur.
Le Joker, la Femme-chat, le Sphinx et le Pingouin forment une alliance afin de kidnapper un chercheur d'une invention révolutionnaire : un procédé permettant de déshydrater les corps humains jusqu'à l'état de poudre, qui, réhydratée redevient humain. Une fois le forfait commis, le quatuor de super-criminels kidnappent les membres du Conseil de sécurité de l'ONU et utilisent l'invention sur eux. Batman et son compagnon Robin aidés de leur fidèle majordome Alfred Pennyworth doivent alors intervenir.