The Riddler escapes from Arkham Asylum with the sole purpose of exacting revenge on the Dark Knight, doing so by placing one of Batman's closest allies, Commissioner Gordon, in jeopardy. With the use of the Batmobile and the Batplane (Batwing), the Caped Crusader must again defend the people of Gotham City against the question-marked villain and his gang of henchmen.
When Judge Maria Vargas is found dead by Mayor Flutie, Batman and Robin must find out who is behind the murder. Once they find out who it is, the duo face the likes of Two-Face and Mr. Freeze before they take on The Penguin in an all-out fight of good versus evil. But when The Penguin finds something out he shouldn't have, the future of Batman and Robin becomes uncertain.
Batman, Robin and Nightwing investigate a string of incidents where a mysterious assailant has been taking down numerous crime organizations all over Gotham City. In their findings, they discover that while the thugs were taken down and no cash was stolen in the crime scenes, The Riddler and The Scarecrow have been lethally drugged with a botanical neurotoxin found only in the Far East. Moreover, blood splatters in the crime scenes indicate that the assailant was reckless, not caring about sustaining gunshot wounds during the fights while drugging the villains. Batman concludes that the assailant is Batgirl, who is being manipulated by Poison Ivy; the gunshot wounds she sustained were her failed attempts at breaking the spell. Batman and Robin confront Poison Ivy, who attempts to kill Batman with a lethal dose of the neurotoxin. An injured Batgirl, however, briefly breaks Poison Ivy's spell on her to block the shot as the villainess makes her escape and Nightwing rushes to the scene with the antidote.
Enfant, le milliardaire Bruce Wayne voit ses parents assassinés par un voleur des rues, qui en voulait au collier de perles de la mère de famille. L'orphelin se jura de venger leur mort en se lançant dans une bataille à vie contre le crime organisé. Pour cela, il crée un justicier masqué nommé Batman, et cache cette identité secrète derrière celle d'une image de playboy flambeur.
À Gotham City, un couple fortuné, Tucker et Esther Cobblepot (Paul Reubens et Diane Salinger), abandonne son enfant à la naissance en le jetant dans les égouts à cause de sa difformité. Il est recueilli et élevé par les manchots du zoo. Trente-trois ans plus tard, Oswald Cobblepot (Danny DeVito) a grandi dans les égouts et refait surface comme un criminel nommé Le Pingouin. Il kidnappe un industriel millionnaire, Max Shreck (Christopher Walken). À cause des preuves rassemblées par le Pingouin des activités criminelles des affaires de Shreck, ce dernier lui propose de le sortir des égouts et de le faire entrer dans l'élite de Gotham. Le Pingouin élabore un plan pour faire son entrée dans le monde public en se faisant passer pour un héros. Il fait kidnapper le fils du maire pour ensuite le délivrer lui-même. Malgré la popularité du Pingouin, le millionnaire Bruce Wayne, alias Batman (Michael Keaton), reste sceptique sur ce dernier. Il enquête sur le passé du Pingouin et établit un lien avec un gang de criminels, le Gang du Cirque du Triangle Rouge. Le gang a récemment fait des ravages sur Gotham, entrainant la disparition de plusieurs enfants. Il décide de défendre Gotham contre eux.
Le Joker, la Femme-chat, le Sphinx et le Pingouin forment une alliance afin de kidnapper un chercheur d'une invention révolutionnaire : un procédé permettant de déshydrater les corps humains jusqu'à l'état de poudre, qui, réhydratée redevient humain. Une fois le forfait commis, le quatuor de super-criminels kidnappent les membres du Conseil de sécurité de l'ONU et utilisent l'invention sur eux. Batman et son compagnon Robin aidés de leur fidèle majordome Alfred Pennyworth doivent alors intervenir.
À Gotham City, les quatre plus grands criminels (le Joker, le Pingouin, le Sphinx et Catwoman) font peser une terrible menace. Les super-héros Batman et Robin vont faire face à ces méchants et devront même aller dans l’espace pour contrecarrer le plan diabolique de leurs ennemis.
Bruce Wayne est devenu adulte et va devenir Batman à 25 ans dans un Gotham ravagé par le crime. Le film le suit dans sa première année. Jim Gordon débarque à Gotham comme inspecteur et s'occupe de l'affaire Batman. Ce dernier le sauvera plus d'une fois…
Alors que Bruce Wayne et Selina Kyle (et leurs alter égo, Batman et Catwoman) entament une relation amoureuse, un nouvel ennemi apparait; un ennemi qui a manipulé des criminels aussi puissants que Bane, Poison Ivy, L'Épouvantail, Gueule d'argile, Harley Quinn ou encore le Joker; un ennemi qui a découvert la véritable identité de Batman et tous ses secrets; un ennemi qui a un plan pour détruire le justicier, ses proches et ses alliés définitivement: Silence...
L'intrigue se passe dans un futur proche, où Batman n'est plus qu'un souvenir pour ceux qui ont connu sa croisade contre le crime et un mythe pour les plus jeunes.
Lorsque Mr Freeze séquestre Batgirl pour lui prélever des organes afin de ramener à la vie sa défunte épouse, c'est au tour de Batman et Robin de les retrouver avant que la chirurgie ne débute.